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封閉

在轉(zhuǎn)膜之后，也就是抗體孵育之前，需要對(duì)膜進(jìn)行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有BSA，脫脂奶粉，血清等，一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用；不能用于磷酸化抗體對(duì)蛋白磷酸化的檢測(cè)；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個(gè)脾氣。

對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。 無(wú)論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，和低效之間往往只有數(shù)倍的差異， 而抗體的效價(jià)可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價(jià) 不被過(guò)分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結(jié)合的蛋白，包括單克隆抗體和多克隆抗體；二抗：第二抗體能和一抗結(jié)合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。一般二抗都會(huì)偶聯(lián)可以檢測(cè)的標(biāo)記（如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），用來(lái)檢測(cè)一抗；如果一抗本身偶聯(lián)有這些標(biāo)記，則不需要二抗，就是所謂的直接WB。

那么如何正確的來(lái)選擇二抗呢？*根據(jù)一抗的種屬來(lái)源選擇二抗；第二根據(jù)一抗的類(lèi)型選擇二抗，根據(jù)單體數(shù)量和重鏈分類(lèi)，將抗體分為IgA，IgD，IgE，IgG，IgM五類(lèi)。其中又可分為幾個(gè)亞型：IgA1-2，IgG1a，2a，2b，3，IgM1-2。

顯色

酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開(kāi)發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達(dá)到pg別，甚至還有 Femto級(jí)別的，靈敏度超過(guò)了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡(jiǎn)便且成本低。zui為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過(guò)氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，屬于過(guò)氧化物酶POD類(lèi)）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見(jiàn)的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

1.曝光后背景過(guò)高且不均勻

封閉不充分：延長(zhǎng)封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑；一抗?jié)舛冗^(guò)高：增加一抗稀釋倍數(shù)；抗體孵育溫度過(guò)高：4℃孵育；二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)：設(shè)置二抗對(duì)照（不加一抗），降低二抗?jié)舛取?/span>

洗膜不充分：增加洗膜次數(shù)

2.沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配：訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物，可通過(guò)設(shè)置內(nèi)參驗(yàn)證二級(jí)系統(tǒng)的有效性； 更換更好的抗體；一抗，二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間封閉劑與一抗有交叉反應(yīng)：封閉時(shí)使用溫和的去污劑，更換封閉劑樣本中無(wú)靶蛋白或靶蛋白含量過(guò)少，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加樣本上樣量；轉(zhuǎn)膜不充分還洗膜過(guò)度：使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透，正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿過(guò)度洗膜；曝光時(shí)間過(guò)短：延長(zhǎng)曝光時(shí)間，更換更靈敏的發(fā)光液

3.背景有白色/黑色斑

轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

A549細(xì)胞，A549細(xì)胞培養(yǎng)凍存：

１．將細(xì)胞消化下來(lái)，移入離心管離心，棄上清

２．準(zhǔn)備凍存液比例：５０％ＦＢＳ＋４０％培養(yǎng)基＋１０％ＤＭＳＯ（現(xiàn)用現(xiàn)配）

３．加１．５凍存液在離心管中，將細(xì)胞吹打均勻，移入凍存管內(nèi)．

放入－２０度冰箱２－４小時(shí)后．再放入－８０度冰箱過(guò)ye，第二天放入液氮罐保存.

A549細(xì)胞，A549細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染如下：

1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。

2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無(wú)雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見(jiàn)呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤(pán)里也加上飽和量的硫酸銅?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤(pán)加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。

3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢凋亡。

4、黑蛟蟲(chóng)：可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。

5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開(kāi)始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

6、原蟲(chóng)：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，zui終形成惡性循環(huán)。

A549細(xì)胞，A549細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)輸：凍存的細(xì)胞干冰運(yùn)輸，復(fù)蘇的細(xì)胞冰袋運(yùn)輸。冬季我們會(huì)選擇全血清包被細(xì)胞運(yùn)輸，運(yùn)輸途中細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，避免天氣過(guò)冷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。