人同型半胱氨酸(Hcy)Elisa 試劑盒說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用

檢測(cè)范圍：0.8 nmol/ml –50 nmol/ml

zui低檢測(cè)限：0.2 nmol/ml

特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人Hcy，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

有效期：6個(gè)月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中Hcy含量。

說(shuō)明

1. 試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2. 濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
4. 剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

概述

同型半胱氨酸Hcy又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，不屬于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來(lái)源于蛋氨酸的分解代謝。Hcy是甲硫氨酸代謝形成的中間產(chǎn)物。，在體內(nèi)由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成，有兩種途徑。再甲基化途徑：約有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以維生素B12為輔因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，發(fā)生再甲基化，重新合成蛋氨酸。轉(zhuǎn)硫途徑：另外約50%的Hcy經(jīng)轉(zhuǎn)硫途徑不可逆生成半胱氨酸和α酮丁酸，此過(guò)程需維生素B6依賴的胱硫醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶參與。Hcy合成和代謝途徑及其相關(guān)的酶系統(tǒng)、葉酸、維生素B12和維生素B6的缺乏、MTHFR、甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血癥。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗Hcy抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Hcy抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Hcy呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：                                 一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                 2瓶(凍干品)。
3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：                           1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：         1×10ml/瓶。
5. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：  1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：              1×120ul/瓶（1：100）。
7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：        1×120ul/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）：                            1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：  1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：                      1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃置夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N"倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N"。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為50 nmol/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.2 nmol/ml，3.2 nmol/ml，1.6 nmol/ml，0.8 nmol/ml.，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制25 nmol/ml l標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 nmol/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul生物素標(biāo)記抗體加990ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990ul辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100ul（取1ul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
2. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200ul/每孔，甩干。
3. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul，37℃，60分鐘。
4. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200ul/每孔，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)備注

1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請(qǐng)避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。