加樣、溫育和洗板操作不當(dāng)尤其影響ELISA測(cè)定結(jié)果

ELISA測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?；鄯f生物。

    加血清樣本及反應(yīng)試劑：

    在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是惟一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是，加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孑L之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。慧穎生物。

    溫育：

    溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。zui為常用的溫育溫度有37~C和室溫，其次是43~C和2～8~C。慧穎生物。

    溫育這一步是臨床ELISA測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。目前國(guó)內(nèi)通常ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 0．5～lh，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2h。一般來(lái)說(shuō)抗原抗體反應(yīng)在37℃下需要1～2h才能有較*的結(jié)合，低于1h，可能會(huì)影響測(cè)定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：

    1．要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間  一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和（或）反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)，而在臨床實(shí)驗(yàn)室中，很少有天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠，以致弱陽(yáng)性樣本測(cè)定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長(zhǎng)板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測(cè)量觀察即可?；鄯f生物。

    2．溫育溫度的選擇  在有的ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1h，另一種則為43℃下45min。從免疫測(cè)定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來(lái)看，在較低的溫度下反應(yīng)較長(zhǎng)的時(shí)間zui為*，如2—8℃下反應(yīng)24h。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動(dòng)的加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對(duì)分子含量較多的強(qiáng)陽(yáng)性樣本的測(cè)定沒(méi)有問(wèn)題，但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測(cè)定中盡量使用較低溫育溫度較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件?；鄯f生物。

    3．“邊緣效應(yīng)”的排除  以前在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板外周孑L與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同。但有研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性?；鄯f生物。

總而言之，在臨床ELISA測(cè)定中，要保證好的測(cè)定效果，可采用下述簡(jiǎn)單辦法來(lái)確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆募啿挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?，放于溫箱中，這樣就會(huì)因?yàn)榘鍡l孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。慧穎生物。

    洗板：

    固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成分分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。因此，洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0．05％山梨醇—20的中性PBS，山梨醇—20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其在洗滌中的作用機(jī)制是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動(dòng)吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動(dòng)吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中山梨醇—20濃度高于0．2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測(cè)定下限?；鄯f生物。

    在實(shí)驗(yàn)室中，ELISA測(cè)定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。手工洗板進(jìn)行下一步測(cè)定操作。洗板機(jī)洗板則是將上述手工操作改由洗板機(jī)進(jìn)行，使用洗板機(jī)洗板的一個(gè)特點(diǎn)是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機(jī)洗板至*所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機(jī)。在特定臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的洗板機(jī)，到底洗多少次能達(dá)到要求，可進(jìn)行下面這個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)：選擇4X8 HBsAgELISA包被板條，每2X8孔分別加入相同一份弱陽(yáng)性和一份陰性樣本，按試劑盒說(shuō)明加入酶結(jié)合物并完成溫育后，洗板孔時(shí)按第1排4孔洗1次、第2排4孔洗2次、第3排4孔洗3次……直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測(cè)定，如洗3次后，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測(cè)定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽(yáng)性／陰性值保持zui大不變，則可以認(rèn)定該實(shí)驗(yàn)室所用洗板機(jī)3次洗板即可達(dá)到要求。慧穎生物。