Gibco 10082-147 細胞培養(yǎng)小常識

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熱滅活目的是為了去除血清中補體等對熱敏感的物質(zhì)，但是在胎牛血清中對補體的滅活則明顯沒有必要。Triglia和Linscott曾對商業(yè)胎牛血清中的補體成分進行測定，他們發(fā)現(xiàn)胎牛血清中含有的C1，C6僅達成年動物血清的1-3%，而其它補體成分僅有成年動物的5-50%，至于補體的主要成分C3在胎牛血清中則幾乎不能檢出。通過補體固定實驗，我們也在多個不同批次的胎牛血清中獲得了相似的結(jié)果。即使是在未稀釋的血清中，也未發(fā)現(xiàn)有明顯的溶血現(xiàn)象。

另外，多數(shù)實驗室在培養(yǎng)前將培養(yǎng)液進行預熱的過程，也對熱敏的補體有滅活的作用。 總之，多數(shù)細胞培養(yǎng)中血清的熱滅活并不是必要的。很多場合下，熱滅活并不會改善細胞的生長，卻降低了支持細胞生長的能力。即使在少數(shù)有促進的情況下，其促進的比率也是微不足道的。另外，血清的熱滅活導致的沉淀常常被認為是微生物的污染，從而給用戶和供應商都帶來不必要的麻煩。我們建議，對于那些對血清進行滅活的用戶，需要通過試驗來證實其必要性，確定滅活的適當條件；在滅活過程中，需要嚴格認真監(jiān)測，并選擇一個可重復的方案進行操作。

Gibco 10082-147  細胞培養(yǎng)小常識

1）切記，細胞培養(yǎng)基的儲存條件是2-8℃。如果細胞培養(yǎng)基不小心被凍，您應該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

2）貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫鈉導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15min，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

3） 當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

4）一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

5）總之，大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

6）血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體系統(tǒng)。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的。相反，對大部分細胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加，使您誤以為污染。

7）在進行傳代培養(yǎng)時，我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代，不進行活性檢測，您可能接種比你認為的低得多的濃度的細胞，這常?？赡軐е律L緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。

8）在訂購的細胞到達后，應立即復蘇，如果培養(yǎng)基還沒有準備好，可將其放入液氮中，盡快復蘇。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nèi)。

9）細胞復蘇往往是比較容易出問題的步驟。請在訂購細胞時就向供應商索取詳細的復蘇步驟，并仔細閱讀。有些供應商就不推薦在復蘇時離心，對此類細節(jié)，應特別留意。

10）如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

A) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

B) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

C) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

D) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30min的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

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外泌體（Exsome）發(fā)展歷程：

外泌體的發(fā)現(xiàn)要追溯到1986年，Eberhard G. Trams和R.M.Johnstone在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。隨后的10年，外泌體并未受到足夠的重視。直至1996年，G.Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細胞來源的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗腫瘤反應。1998年，L.Zitvogel等發(fā)現(xiàn)樹突細胞（DC cell）也能產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動了特異性的CTL殺傷作用，促進了T細胞依賴的抗腫瘤效應。

2007年，H.Valadi等發(fā)現(xiàn)，細胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質(zhì)。這意味著細胞可以通過外泌體影響另外一個細胞，甚至可以把自己的基因強加給另外一個細胞。研究人員逐漸對小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的外泌體與正常細胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，腫瘤周圍組織細胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細胞的能力，等等。2013年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎頒給了三位科學家，他們分別是美國科學家James E. Rothman和Randy W. Schekman，德國科學家Thomas C. Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部囊泡（外泌體等）運輸調(diào)控機制。使外泌體的研究達到全新的高度。就外泌體的研究方向而言，干細胞、免疫、microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領(lǐng)域。

2015年JHuan等人證實了急性髓細胞白血?。ˋML）的外泌體在白血病的骨髓微環(huán)境中具有抑制造血干細胞的功能。同年WANGY等人發(fā)現(xiàn)誘導多能干(iPS)細胞的外泌體可以在心肌細胞受到急性心肌缺血（MIR）影響時，給心肌細胞傳送保護信號。

目前，已有越來越多的學者開始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。2015年德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的一項研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發(fā)布，研究發(fā)現(xiàn)存在于癌癥外泌體（exosomes）上的glypican-1 (GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測到的胰腺疾病跡象之時，GPC1+ crExos就檢測到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA 19-9生物標志物，GPC1+ crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。

“不同于循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)需要大量的新鮮血液，在大約30年前保存到冷凍庫的血液樣本中也可以檢測和分離出GPC1+ crExos。可以從儲存樣本分離出的癌癥外泌體中提取出DNA、RNA和蛋白質(zhì)，用于進一步的遺傳和生物分析。因此，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標記物，分離出它們還可為我們提供一個癌癥特異性信息的寶庫。”由于胰腺癌確診時常常已到晚期，只有15%的患者適合于接受手術(shù)。如果能夠早期檢測到癌癥，就可以采用胰十二指腸切除術(shù)來治療胰腺癌患者。

目前有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上。其中，外泌體的粒徑表征和濃度信息是極為重要的參數(shù)。

外泌體的分離

目前，外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾三種方法。

超速離心：耗時耗力，往往需要8-30個小時；每次zui多只能處理6個樣品；需要大量的起始材料；產(chǎn)量不高。需一臺超速離心機。

磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面*的表面標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

外泌體分離：

通過簡單離心，從體液、血液、尿液、細胞中分離外泌體（Exosome），相比超速離心，安全、快速，經(jīng)過兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白，從而獲得高純度和高產(chǎn)量的外泌體。

外泌體RNA/蛋白的分析

目前，通常使用組織診斷法進行癌癥檢測，如熒光原位雜交（FISH）和免疫組織化學（IHC）。但是這樣基于組織診斷的方法具有很大的局限性，因為需要較大量的組織樣本，其不能對癌癥變化進行實時監(jiān)控，不能準確地反映當前的疾病狀態(tài)。而外泌體診斷測試通過從尿液、血液和體液中提取的外泌體獲得遺傳信。Exosomes是由所有含RNA、DNA和蛋白的活細胞釋放的信使。因為Exosome包含來源于母細胞的信息，因此在腫瘤學上，基于外泌體的體液活檢對整個腫瘤活動提供了一個實時監(jiān)控并可對疾病的重要變化進行檢測。

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